在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器上。

4. PCR（PCR擴增區）

（1）取樣本處理區準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。

（2）按下表設置儀器核酸擴增相關參數進行PCR擴增。

反應體積	25 μL	通道選擇	FAM通道采集禽白血病病毒熒光信號
PCR 反應條件	步驟	條件	循環數
	反轉錄	42℃：10分鐘（min）	1
	預變性	95℃：3分鐘（min）	1
	預擴增	95℃：5秒（s）	5
	預擴增	55℃：40秒（s）	5
	PCR擴增	95℃：5秒（s）	40
	PCR擴增	55℃：40秒（s）（此階段結束時采集熒光信號）	40

注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正，設置淬滅基團選擇 None。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。

（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數增長期。

2.標本結果判定：

（1）陽性：標本檢測結果Ct值≤35或有明顯指數增長期。

（2）可疑：標本檢測結果Ct值在35～38范圍內。此時應對標本進行重復檢測，如重復實驗結果Ct值仍在35～38范圍內，有明顯指數增長期，則判定為陽性，否則為陰性。

（3）陰性：標本檢測結果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗結果的解釋】

通道及檢測結果	標本檢測結果解釋
FAM	標本檢測結果解釋
+	標本中檢出禽白血病病毒RNA
-	標本中未檢出禽白血病病毒 RNA

【檢驗方法的局限性】

1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的檢出限shi可能會發生假陰性的結果。

2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成RNA降解而產生假陰性結果。

3. 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發生交叉污染，則容易得到假陽性結果。

【產品性能指標】
產品的檢出限為10² Copies/mL，產品CV值≤5%。

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